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腫瘤相關RNA甲基化經典套路

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(篇幅較長,耐心讀,一定受益匪淺)

研究目的與意義1974年首次發現m6A甲基化,它是一種RNA分子上的甲基化修飾,m6A修飾在哺乳動物細胞中是動態可逆的,類似于DNA和組蛋白修飾的另一種表觀遺傳調控,近年來m6A甲基化已成為生命科學領域的研究熱點。通過諸多學者辛苦研究,結果表明在mRNA中發現的m6A修飾可以調節癌細胞的生命活動。另外我們知道EMT是上皮細胞獲得間充質細胞特質的一種重要現象,通過EMT誘導轉錄因子(例如SnailSlugTwistZeb)來抑制e-cadheri的表達促進癌細胞的轉移,此外,Snaile-cadherin表達的重要轉錄因子,近年來圍繞EMT的表觀遺傳調控因素做了諸多研究,發現DNA甲基化及組蛋白修飾等均可參與腫瘤細胞EMT的發生發展,但mRNA修飾對腫瘤細胞EMT的影響尚未揭示。

一、癌細胞中EMTmRNA的甲基化水平調控

 

以上所有這些數據表明用TGF-β處理的癌細胞正在進行EMT過程。

為了證明m6AEMT過程中的作用,作者使用CRISPR / Cas9編輯系統,在HeLa細胞中敲低METTL3,形成 METTL3Mut/− HeLa細胞。下圖是METTL3野生型及METTL3Mut/− HeLa細胞中的蛋白表達情況

進一步通過LC-MS/MS分析,結果顯示,METTL3 Mut/− HeLa 細胞的m6A水平顯著低于野生型細胞,這也證實了METTL3作為mRNAm6A具有介導催化作用。

這些數據表明METTL3的缺失可以抑制癌細胞EMT的發生;

 

進一步通過蛋白質印跡分析顯示ALKBH5的過表達增加了E-Cad同時降低了HeLa細胞中的MMP2FN

此外,在METTL3Mut/−HeLaMett13敲低Huh7細胞中恢復了TGF-β誘導的E-Cad下調和FN上調。 

根據上述數據已經知道METTL3的缺失可以抑制癌細胞EMT的發生作者進一步研究了METTL3的臨床作用。TCGA數據顯示,METTL3在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織

364名肝癌患者中,METTL3的表達與CDH1 mRNA呈負相關。這種關聯與上述數據呈現結果一致 

根據Bertero等的報道,TGF-β可通過Smad2 / 3METTL3-METTL14- WTAP復合物之間的相互作用誘導人胚胎干細胞(hESCs)中的mRNA甲基化。通過使用Smad2 / 3抑制劑B43154210μM)預處理HeLa細胞,然后用TGF-β進一步處理3天,通過LC-MS/MS測定總mRNAm6A的比例,來計算m6AmRNA上整體的甲基化程度。發現Smad2/3抑制劑SB431542SB)可以阻礙TGF-β誘導的HeLa細胞中m6A的上調。 

二、EMT的細胞,m6A會調控其它基因的變化

 

 

 

 

總的來說,m6A-seq數據顯示m6A修飾發生在EMT期間與細胞連接,粘附和遷移相關的少數基因上。

為了驗證Sainl是參與m6A調節的癌細胞EMT的潛在靶點,作者通過在EMT期間鑒定84EMT的相關基因和61 m6A調節基因(大于2m6A變化),最終確定了四個重疊基因。分別為SANI1CTGFMSNCTNNB1,在四種鑒定的基因中,Snail被認為是控制EMT的重要轉錄因子。作者的數據證實Sainl mRNAm6A修飾,并且在EMT進展期間在CDS3'UTR區域中m6A的顯著富集,另外,作者通過RIP技術,發現在EMT細胞中,m6A水平的Sainl-mRNA顯著增加,富集倍數與對照相比約為2.3倍。

 

 

接下來,作者研究了HeLa細胞中敲低METTL3、以及過表達ALKBH5Snail蛋白的表達情況,。在METTL3缺失和ALKBH5過表達的兩種情況下,作者觀察到HeLaHepG2細胞中Snail蛋白水平的降低而ZEB1表達沒有變化。

為了證實m6ASnail表達作用,作者用TGF-β處理野生型和METTL3Mut /-HeLa細胞。結果顯示,在METTL3Mut /-HeLa細胞中,TGF-β誘導的Snail表達低于對照細胞這表明m6A參與TGF-β誘導的癌細胞中Snail的表達

 

 

四、m6A促進癌細胞中Snail mRNA的翻譯

 

Act-D處理野生型和METTL3Mut /-HeLa細胞以阻斷轉錄。結果顯示野生型細胞中pre-mRNAmat-mRNA的半衰期顯著短于METTL3Mut /-HeLa 細胞。表明m6A修飾可能引發pre-mRNA的剪切和癌細胞中Snail mat-mRNA的降解

另外作者補充證實,SnailYTHDF2的靶標,其負責m6A介導的轉錄物mRNA去穩定化。過量表達YTHDF2可降低HeLa細胞中成熟Snail mRNA的表達和穩定性

此外,作者用MG132預處理METTL3Mut /-HeLa細胞以抑制蛋白體外酶活性使用CHX阻斷蛋白翻譯,然后用TGF-β處理。結果數據顯示,在CHX而非MG132存在下, TGF-β誘導的METTL3Mut /-HeLa細胞中的Snail表達減弱。

隨后作者將Snail CDS連接到多克隆位點(MCS)構建了pmirGLO-Snail熒光素酶報告基因。 雙熒光素酶測定顯示,SnailMETTL3Mut /-HeLa細胞中的翻譯效率顯著低于野生型細胞。

 

下面作者對RNA進行分類,通過多聚核糖體分析,發現METTL3Mut /-HeLa細胞中80S的核糖單體和多聚核糖體都低于野生型細胞。

表明在EMT過程促進SNAI1 mRNA的轉錄翻譯。

作者通過對m6A-RIP測序,數據顯示CDS區域中m6A峰值位于第20條染色體上,48,600,490 to 48,600,630且在3 'UTR

作者鑒定了3GGAC motif,分別位于CDS區域和Snail mRNA3'UTR區域;

下面作者對m6A甲基化對SNAI13'UTRCDS區域分別作了詳細研究。

這表明3'UTR上的m6A甲基化可能不參與m6A修飾調節的Snail表達;


數據顯示,在過量表達pcDNA-Snail-CDS-mut1METTL3Mut細胞中部分上調了Snail表達水平(上圖)。將pcDNA-Snail-CDS-WTpcDNA-Snail CDS-mut1 / mut2轉染的HeLa細胞進行TGF-β處理。 蛋白印跡結果顯示,TGF-β誘導的pcDNA Snail-CDS-mut1Snail表達低于pcDNA-Snail-CDS-WTpcDNA-Snail-CDS-mut2下圖

總之,結果數據表明SNAI1 CDS區域中的m6A是表達調控的主要位置;

 

由于真核生物的翻譯延伸是由兩個延伸因子作用進行的,:eEF-1eEF-2,作者觀察MetE13Mut -HeLa細胞中eEF-1eEF-2結合Snail mRNA的變異。數據顯示,在METTL3Mut-HeLa細胞中Snail mRNAeEF-2之間的結合顯著低于HeLa細胞中的結合。 此外,通過蛋白定性分析表明,得到了類似的結果。 

六、m6A與癌細胞發展有關

這表明Snail參與了METTL3的體內轉移作用。

 



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